2013年末，《Nature Methods》杂志将年度技术授予了单细胞测序（single-cell sequencing）。同时，杂志还介绍了2014年值得关注的技术，包括CRISPR和基因组编辑、神经学工具、原位测序、单颗粒低温电子显微镜等。

新一代测序技术在RNA测序上的应用已带来RNA内容的更全面了解。然而，现有的RNA测序技术是基于纯化好的核酸，却丢失了序列的空间背景。原位测序（In situ sequencing）有望更深入地了解细胞的基因表达程序及形态与局部环境之间的关系。《Nature Methods》编辑Tal Nawy认为，尽管预测这一技术的最终形式和潜力还为时过早，但目前已开始朝这一方向努力。

原位杂交等方法一直用于定位完整细胞和组织中的序列，但其限制在于必须清楚目标序列。在测序方面，许多技术都利用基于光的读取，这表明它们可能与完整组织的成像相兼容。但扩增和测序反应需要特殊的底物，或需要在乳液中彼此分离。

去年10月，瑞典斯德哥尔摩大学的研究人员在《Nature Methods》上发表了一种新策略：滚环扩增（rolling circle amplification）。这种方法依赖一种锁式（padlock）探针，它与目标序列的任一侧杂交，以形成环状模板，进行复制。由于产物是拴在模板上的，这提供了可靠定位，并可通过连续的寡核苷酸探针掺入，实现原位测序。

这是第一次实现了在细胞或者组织中对目的RNA分子进行测序，极大地保留了RNA分子的位置信息。也就是说，得到序列的同时，我们还能够知道这些序列来自哪些细胞或者组织的哪个部位。

目前，这种技术仍处于原理验证的阶段。虽然测序长度只有4个碱基，但已经可用来检测基因组中一些存在突变的短序列。研究人员以HER2转录本阳性的人乳腺癌组织为样本，证明了转录本片段的测序可在组织切片中直接开展。

今后，有必要增加单细胞中可被拷问的转录本数量和序列长度，以及平衡图像分辨率和组织范围的成像能力。在这一放大过程中，图像配准方法是关键要素，而定量与形态关联的工具也是必要的。

这一技术的最终目标是测序多个位点，甚至是转录组或基因组中大的片段，但这仍需要解决信号密度的问题：在如此狭小的空间内，细胞包含了太多可被成像的信息。未来，我们有望看到测序与生物学背景的更紧密连接。

来源：生物通