一、编号：YQ0701

二、标题：5700型荧光定量PCR仪操作规程

三、关键词：PCR 荧光定量 操作规程

四、目的：规范5700型PCR仪操作程序

五、背景知识：ABI公司5700PCR仪由热循环仪、高压汞灯、计算机和定量PCR软件组成。使用96孔样品基座，可同时扩增96个0.2ml的PCR反应管或一个96孔PCR反应板内的样品。温度控制范围：4-99.9摄氏度；最大循环次数为99次。适用于分析某一基因的拷贝数和转录水平，对特异病原体DNA和RNA进行定量研究。

六、原理：荧光定量PCR（FQ-PCR）的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光发射基因FAM（6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518nm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA（6-羧基四甲基若丹明，荧光发射峰值在582nm处），探针的3’开端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动到探针切断，淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，因此用该技术可对模板进行准确定量。反应结束后，通过电脑分析，可直接给出定量结果，由于荧光探针的引入，显著提高了实验的特异性。

七、材料和仪器：5700型PCR仪、RT反应产物

八、操作步骤

1、依次打开总电源，稳压器电源。打开windows NT工作站。

2、同时按下Ctrl+Alt+Delete等录，弹出登录信息对话框。

3、键入下列信息:

User name：PCR

Password：5700

单击OK，等待计算机完成启动动作。

4、打开9600热循环仪和GeneAmp 5700核酸序列检测器电源。

5、双击电脑桌面上的GeneAmp 5700 SDS图标，或从开始菜单选择GeneAmp 5700 SDS。在出现新的样品板(New Plate Application)窗口选中5700和5700 Quantiation，单击OK。

6、在出现的样品板窗口，单击样品类型下拉菜单，为每个样品孔选择正确的样品类型。选中所以要指定引物/探针的已命名的样品孔，点击工具栏内的P按钮，弹出引物/探针调色板，为特定的样品孔选择引物/探针。

7、选中所以想指定已知DNA起始拷贝数的标准品样品孔，单击工具栏的Q按钮，弹出定量对话框，对于每一个所列出的引物/探针，单击对应的定量区域，输入已知的起始拷贝数，单击OK。在样品板窗口，单击仪器页面，设置好热循环参数。

8、除去96孔反应板的光学支持基座，将96孔反应板安放到9600热循环仪的加热块上，将GeneAmp 5700序列检测器滑到样品池上方，顺时针旋转检测器顶部的大旋钮，压紧盖子。

9、从File菜单，选择Save选项，保存好样品板文档。单击仪器窗口的Run按钮，进行PCR热循环。

10、PCR热循环完成后，单击结果页面，单击Preferences按钮，在弹出的对话框中设置基线和阀值。

11、在分析菜单下执行Analyze，软件分析完成。

12、选中想要数据后进行打印。

13、关闭9600热循环仪和GeneAmp 5700核酸序列检测器电源，关闭计算机。

14、依次关闭稳压器电源，总电源。

九、注意事项

1、反应循环数一般应在35个以上，45个以下，太少易出现假阴性，太多则背景干扰信号太多。

2、引物设计应尽量避免出现二聚体和发夹结构，最好每次都利用熔解曲线进行考察。

3、需要尽量减少模板的反复冻溶。