Western Blotting依然是目前分离和检测蛋白最常用到的一种技术方法，但是要将这种技术变成你的有利手段，并不容易。因此优化实验操作手册至关重要，但是，正如Bio-Rad成像系统市场经理Ryan Short所说的，“大多数研究人员并不是Western blot技术专家——他们要解答的是更大的问题”，Ryan继续说道，“问题是大多数人都不知道何处需要优化。坦率地说，Western blot检测过程耗时太长。如果每个印迹实验都有花费你两天时间，那么还有多少时间确实能用于优化Western blot呢？”当然，类似抗体质量，封闭液和转印效率等因素也扮演了关键角色，让我们来仔细看看，现今还有哪些优化的技巧和工具。
加入合适数量的蛋白
虽然步骤优化至关重要，但是传统的Western Blot整个过程本身过长确实也带来了困难。Short相信一个成功的Western Blot实验操作指导中，最重要的因素之一就是确定每份凝胶中加入的蛋白量。
“这是非常重要的，因为大多数进行WB实验的研究人员都有一个兴趣蛋白，需要与内参（看家蛋白）比对”，Short说，“如果您的兴趣蛋白是一个低表达的蛋白，而你的内参蛋白是一种高表达的蛋白，那么在检测的动态范围内就必须有两种蛋白，以确保结果的可靠性。因此可能需要加大低表达蛋白的数量，大概有50-60ug蛋白，但在这个量上内参蛋白信号可能会远远超出了线性检测范围了。了解这些动力学对于Western blot获得好结果十分重要。”
有效的封闭：脱脂牛奶以外
使用正确的封闭液将获得完全不同的一个结果。虽然牛奶是经常被使用到的封闭液，但现如今这种封闭液也许不如高质量商业化的封闭液。“封闭液应该结合到膜上不与相应抗体结合的区域”，Thermo Scientific公司Priya Rangaraj表示，“如果做不到这一点，你会看到斑点和增加的背景”。
目前Western市面上一些封闭液包括Thermo Scientific的StartingBlock Blocking Buffer，LI-COR Bioscience公司的Odyssey Blocking Buffer，以及来自Bio-Rad的PBS（含有1%酪蛋白封闭液）。
“研究人员耗费大量的时间去去调整，检测各种一抗和封闭液”，“抗体的性能在与与正确的封闭液作用的时候，会得到显著改善”，LI-COR Bioscience公司的生化产品技术专家Shawn Mischnick说。
化学发光检测：选择一个长时稳定的信号
优化过程中另外重要的一点就是，检测信号的质量和稳定性，Advansta公司首席科学家Dmitry Bochariov说，“底物信号长时稳定，这有助于减少底物和培养基之间不一致性造成的相关变量，以及当印迹成像和曝光时产生的变量，”Bochariov说，“控制和复制这些变量是非常困难的，因为它们涉及人工处理的印迹，带有保护层，并且与记录工具，或者成像系统设备等其它人为因素有关。这些因素长期稳定的化学发光输出，可以大大弥补所有这些变量。”
比如说Thermo Scientific化学发光底物SuperSignal Substrates，就有针对三个不同靶标水平的试剂（皮克，中级豪微克，低级飞克）。
放大低表达蛋白信号的另一种工具就是Thermo Scientific的新产品：SuperSignal Western Blot Enhancer，这是一种增强剂，包含有两种试剂：抗原预处理液和一抗稀释液，能将信号强度和灵敏度提高3-10倍，从而显著降低背景，并增强低丰度和弱免疫反应性抗原的检测。
SuperSignal增强剂使用起来也很简单。在转印之后，封闭之前，用足量的抗原预处理液浸泡膜10分钟。一抗杂交前用一抗稀释液稀释一抗。其他操作均按照Western blotting的标准操作流程进行。此增强剂可用于PVDF膜或硝酸纤维素膜，并与荧光、比色法和化学发光检测兼容。
“增强剂不仅增加了信号，使得抗原表位更加容易接近一抗，而且也降低了背景，”Rangaraj说，“这对于低丰度，或弱免疫反应的抗原或蛋白，特别有用的”。而且，配合上Thermo Scientific的MYECL™成像仪（能进行WB结果数字图像，检测和获取）“基于CCD的成像系统具有相比于传统X光片，高出两倍的敏感性，以及十倍的动态范围，”Rangaraj说。
考虑下荧光检测
许多研究人员都没能充分利用可获得的全范围标记，Carestream Molecular Imaging公司全球体外产品经理Stephanie Noles说，“从化学发光标记到荧光标记的过渡，可谓艰巨，但它确实开辟了所能研究的类型和数量”，她说，“越来越多的荧光抗体出现，用于蛋白检测。新的染料，抗体，和其它标记都在这样一个快速的速度下成为可能，确实令人想要试一试”。
Carestream Molecular Imaging公司新推出的Gel Logic 6000 PRO imager就是一款不仅在ECL化学发光成像上具有高灵敏度，而且也真正实现近红外双色荧光成像以及多色荧光成像应用的一款仪器。“Gel Logic 6000 PRO能检测到一次印迹中的所有化学标记，和荧光标记，”她说，“这大大扩展了研究范围，因为这将不再需要HRP-型抗体的印迹中常用到的去除和重标记过程”。这一成像仪还可以覆盖荧光和化学发光信号，无需再将印迹移来移去了，这样就能同时检测出更多的蛋白。
精简实验流程
减少WB从开始到结束所需耗费的时间，能令实验过程更加优化。Bio-Rad的V3 Western Workflow（3个V代表着可视化，验证和确认（visualize, verify, and validate））可以以两种方式完成精简。
其中V3 Western Workflow的无染色技术利用的是UV激活复合物，这种复合物包裹在Bio-Rad预制胶中，实现整个WB实验中过程可视化，研究人员可以一直看到蛋白，从而帮助研究人员检查这个过程中不同点上印迹的进程。这也就意味着，无需跑上两块胶，然后用考马斯亮蓝染色其中一个来检测另外一个了，现在可以只跑一个凝胶，简单地将它放入成像仪，进行一分钟UV光成像激活，而且也可以在转印后，成像印迹膜，以及凝胶，来评估转印效率。
“我们正在往这个过程中添加检查点，而不是增加额外的时间”，Short说，“事实上，我们已经实现了加速”。
“传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳大约需要40-60分钟的时间，而采用Bio-Rad公司的凝胶，现在需要15分钟或更少时间。这个TransBlot Turbo Transfer System还能将转移时间从从一个小时缩短到约3-7分钟”。
“这个更短的操作流程，更容易优化”，他说，“人们都害怕进行更多的优化，因为他们认为这将增加更多的时间。利用这一系统，如果开始不能有好的结果，但很容易优化。研究人员不仅有更多的时间进行优化，而且也有更多的检测点，来评估过程中需要优化的步骤。”
Western优化过程中另一个挑战就是，在检测动态范围内利用高丰度看家蛋白，来测量低表达的蛋白。“通过这一无需染色的技术，而不是看家蛋白的比对，我们能让总蛋白规范化，”Short说，“这是对于利用化学发光检测进行实验的研究人员来说，特别有用，因为他们需要在检测后去除抗体，然而进行重标记，这要花费2-4个小时。而利用这种无染色技术，就省去了这一大步骤。”
Bio-Rad在这个过程中有一个新工具：称为ImageLab4.1的软件，这个软件能比其他的软件工具，以一种更直观的方式，自动完成这个blot normalization过程。“而不是手动绘制看家蛋白对照表格，Image Lab能分析每条蛋白道，计算出总蛋白量来”Short说,“然后利用运算方法检测兴趣蛋白，并自动计算出规范密度值。”
加州大学戴维斯分校神经生物学系助理教授Aldrin Gomes的实验室采用Bio-Rad的V3 workflow，表示这一系统为他们节省了许多时间，“我们还可以利用这一印迹系统做更多的实验，”他说，“在此之前，我们只能做两个blot。而采用Turbo Blot，我们可以一次跑4块迷你胶（或一大两小）。这使得我们能够尝试不同的条件，所以我们可以更快的优化，比如，我们可以调整转印时间（5分钟vs7分钟），或尝试不同的百分比凝胶“。
Mischnick赞同认为blot优化中最大的局限之一就是时间。“完成并检测WB，可能需要长达8小时，”她说，“LI-COR的Quick Western Kit-IRDye 680RD能结合一抗反应这一步骤，无需二抗，提供一个通用性抗体检测试剂，并节省最多90分钟的总检测时间。”此外，这一试剂盒还包含有不同的一抗，从而免除了购买多个IRDye二抗的需要。
多功能和自动化解决方案
同时运行检测多个样品，可以加快优化的步骤，这能帮助研究人员在不同条件下或不同蛋白浓度的样品中进行实验。LI-COR MPX (Multiplex) Blotting System在一次WB中能筛选多个样品和靶标。“MPX独立通道和多重采样功能避免了，标准的Western blot分析过程中遇到的关于抗体交叉反应的限制，”Mischnick说，“MPX的实验指南为客户提供了在一个实验中对所有检测元素，优化Western blot检测条件的方便。”
而针对高通量的优化，ProteinSimple的Sally就是一款全自动Western blot仪器。利用这个仪器，研究人员只需将蛋白样品加入到一块384孔板中，然后把板放入仪器。其余的就交给Sally。“仪器引导蛋白进入毛细血管，这相当于蛋白道，那儿我们分离蛋白，”ProteinSimple公司的发展总监John Proctor说，“仪器可以完成免疫检测和二抗分析，然后输出所有图片。用户将会得到一系列的图像——它会告诉你所有的毛细血管不同的数据。”
Sally系统还具有其它方面的优势。传统的WB一次只能加入一种一抗，但是Sally可以使用多个一抗，在每个或者穿插毛细血管中都可以用到几个一抗，“例如，Sally系统同时可以运行96个毛细血管，这意味着你在一个实验中针对相同的样品，跑96个一抗反应”，Proctor说，“这将给使用不同一抗，不同样品类型，不同二抗，带来了很大的灵活性。因为有这些许多毛细血管，研究人员就可以进行象限，矩阵或不同的条件的分析，从而在一次实验中，得出一个最终全面优化的分析。
不过Sally系统也存在缺陷，那就是速度，这个系统完成的高通量实验需要时间——96毛细血管需要18-19小时，或overnight。
ProteinSimple的低通量仪器：Simon则能在在3-5个小时中运行12个毛细血管。“Sally运行的时间与传统的WB时间相当，不过现在我们也在进一步将其速度提升，也许5-6个小时吧”，Proctor说。
结语
无论选择的是传统的WB，抑或是高通量WB系统，要想进行良好优化，其中最重要的一个方面就是知道你自己正在尝试做什么，以及为什么。
“重要的是要真正了解所有的技术背后的基本原则和步骤，”Bochariov说，“如果研究人员不理解这些机理和机制，那么就很难看出一个真正能获得发现的优异改进，和仅仅实验伪像之间的区别。”
来源：生物通
