【实验目的】

掌握Western Blot技术的基本原理， 学习Western Blot技术的实验方法， 了解Western Blot技术的应用范围。

【实验原理】

Western Blot（免疫印迹）技术，以蛋白质为检测对象，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。实验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将样品蛋白质分离，再转移到固相载体（PVDF尼龙膜或NC膜）上；固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变；然后以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与其对应的抗体（一抗）发生免疫反应，特异性一抗再与和酶耦联的第二抗体反应，最后在酶的作用下，导致底物显色或化学发光显影，来检测电泳分离的特异性目的靶蛋白。

蛋白质印迹技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异性高、敏感等诸多优点，能从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测。

【实验对象】

待测蛋白质或基因表达产物。

【试剂与器材】

1. SDS-PAGE试剂(见第二十五章第二节)。

2.匀浆缓冲液：1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8)1.0ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。

3. 固相载体：PVDF尼龙膜或NC膜（硝酸纤维素薄膜）。

4. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml (48mmol/L Tris.HCl，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS)。

5. PBS-T(pH7.4)： 0.01mol/L PBS（NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO40.24g）；1g吐温20，加ddH2O至1000ml。

6. 膜染色液：考马斯亮蓝 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O 118ml。

7. 封闭液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01mol/L PBS中。

8. 显色液：化学发光剂（ECL）或DAB 6.0mg，0.01mol/L PBS 10.0ml，硫酸镍胺0.1ml；H2O2 1.0μl。

9. 电泳仪，摇床等。

【实验方法与步骤】

基本方法：①将待检测样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离各组分。② 通过印迹技术把分离样品原位、定量转移到NC膜上。③ 用特异抗体与NC膜上的靶抗原反应，结合上的抗体（一抗）再与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的抗免疫球蛋白（二抗）进行反应（此步骤类似间接ELISA法测抗原的反应）。④最后通过酶与底物作用，产生发光或显色反应来检测靶抗原。实际操作时，常把印迹后的NC膜分成两部分，一部分如上所述做免疫检测，另一部分直接进行蛋白质染色，以便对转移情况做直接观察和判断待测抗原所处位置，并推算其分子量。具体操作步骤如下：

1． 蛋白质样品的制备与SDS-PAGE分离

（１）蛋白质样品获得 ①细菌诱导表达后，样品一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解；②哺乳动物组织通常可机械分散（机械或超声波室温匀浆0.5～1min）并直接溶于SDS凝胶加样缓冲液，然后4℃，13 000g离心15min，取上清液作为样品；③组织培养的单层细胞可用匀浆缓冲液裂解，也可直接在SDS凝胶加样缓冲液中裂解；制备好的样品用做SDS- PAGE分析。

（２）电泳 按常规方法进行SDS-PAGE（(见第二十五章 第一节)。

2． 蛋白质从凝胶转移到NC膜上（半干式转移）

（１）平衡凝胶：用转膜缓冲液平衡，5min×3次。

（２）膜处理: 将滤纸和NC膜，一同在转膜缓冲液中浸泡10min。

（３）转膜：①转膜装置从下至上依次按阳极碳板、3层厚滤纸、PVDF尼龙膜、凝胶、3层厚滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、PVDF尼龙膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。②用支架夹紧上述各层，置电转移槽中，NC膜一侧靠正极，凝胶一侧靠负极。接通电源，40V、约1.5A转移1.5～6h。转移时间长短依靶蛋白分子量大小来调节。③转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹。④将有蛋白Marker的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。

3. 免疫探测 包括被转印到膜上的靶抗原与第一抗体（特异抗体）反应、与酶标第二抗体 (抗抗体) 反应，以及用酶相应的底物处理后进行靶蛋白（抗原）信号检测。

（1）用0.01mol/L PBS洗膜，5min×3次。

（2）加入封闭液（5％脱脂奶粉或2％牛血清白蛋白），浸泡被转印膜，室温或37℃（平缓摇动）反应1～3h，以封闭转印膜上一些非特异性蛋白质的潜在结合位点，避免非特异性反应。

（3）弃封闭液，用0.01mol/L PBS洗膜，5min×3次，振荡。

（4）将封闭好的转印膜浸入第一抗体溶液（按合适稀释比例，用1/2量0.01mol/L PBS加1/2量封闭液稀释）中，抗体液用量约0.2ml/cm2，37℃反应1～2h或4℃反应12h以上，保持平缓摇动。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。

（5）弃一抗，用0.01mol/L PBS分别洗膜，10min×3次，振荡。

（6）加入辣根过氧化物酶（HP）偶联的二抗溶液［稀释方法同（4）］，室温下反应1～2h，保持平缓摇动。

（7）弃二抗，用0.01mol/L PBS洗膜，10min×4次，振荡。

4． 靶蛋白（抗原）检测

（1）化学发光剂（ECL）检测转印膜上靶蛋白信号（近年多用），具体操作按ECL说明书进行，然后于暗室中用膜对X光片曝光，将所得Ｘ光片上的信号条带进行灰度扫描，计算其积分光密度值。新问世的“化学发光数字成像分析仪”已将曝光、扫描与光密度分析集于一体，既减少信号损失，又方便结果保存，还节省胶片。

（2）显色反应检测转印膜上靶蛋白信号（以往常用），将膜放入相应显色剂（DAB）中，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。阳性反应将在靶蛋白相对应的位置上出现有颜色的条带。

检测完毕后，将NC膜浸泡于洗脱液（100mmol/L-ME， 20g/L SDS，62.5mmol/L Tris-HCl，pH6.7）中，50℃，振荡30min，以去除膜上抗体，供再次检测用。

【注意事项】

1.一抗的选择是影响免疫印迹成败的主要因素。多克隆抗体结合抗原能力较强、灵敏度高，但易产生非特异性的背景；单克隆抗体识别抗原特异性较好，但可能不识别在样品制备时因变性而失去了空间构型的抗原表位，且易发生交叉反应。因此，兼有多克隆抗体和单克隆抗体优点的混合单克隆抗体近年特别被推荐，它是由一组能与抗原分子中的不同且不易变性的抗原表位结合并不易出现交叉反应的单克隆抗体混合构成。

2. 如果反应灵敏度不高，可增加凝胶的厚度到1.5mm（厚度超过2.0mm时，凝胶转移效率受限）；也可在电泳条带不发生变形的前提下，尽量提高蛋白样品的上样量。

3. 滤纸/凝胶/转印膜/滤纸夹层组合中不能存在气泡，可用玻璃棒在夹层组合上滚动将气泡赶出，以提高转膜效率；上下两层滤纸不能过大，避免导致直接接触而引起短路。

4.如果出现非特异性的高背景，可观察仅用二抗单独处理转印膜所产生的背景强度，若高背景确由二抗产生，可适当降低二抗浓度或缩短二抗孵育时间；并考虑延长每一步的清洗时间。

5． 一抗与二抗的稀释度、作用时间和温度对检测不同的蛋白要求不同，须经预实验确定最佳条件。

6. 一般情况使用0.45μm的NC膜，0.1～0.2μm的小孔径膜只适合于分子量小于20kD的蛋白质。

7. PVDF尼龙膜较NC膜柔软、结实、灵敏度高，易于操作且蛋白质结合能力强（PVDF膜可结合蛋白质480μg/cm2，而NC膜只能结合蛋白质80μg/cm2）；缺点是PVDF尼龙膜背景也高，需要加强封闭；此外，PVDF尼龙膜若在使用前先行甲醇处理5～10s，以活化膜表面的正电基团，使它更容易与带负电的蛋白质结合，可提高蛋白质在膜上的保留指数。

8． 使用化学发光检测时，试剂须按需要量临用前配置混合。

9. 由于使用X光胶片检测化学发光时不易控制曝光强度，而X光胶片的黑度水平仅仅是在一个很窄的曝光范围内呈线性关系，因此有条件可选用化学发光成像扫描系统进行精确定时连续检测，以得到最好信噪比的图像进行定量分析。

10． DAB有潜在的致癌可能，操作时要小心仔细。